LO10: Приложение на системната биология в областта на биоремедиацията

Въведение

Замърсителите на околната среда са вече съществен глобален проблем, като се има пред вид техните нежелани трудноразградими и ксенобиотични съединения. Установено е, че различни полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ), ксенобиотици, хлорирани и нитро-ароматни съединения се явяват силно токсични, мутагенни и канцерогенни за живите организми.

Някои от източниците на тези замърсители са: химичната (багрила, селско стопанство, фармацевтични препарати и др.) и петрохимичната индустрия (петролни рафинерии, разливи на гориво), металургията (железодобивна и стоманодобивна промишленост, корабостроене и др.), енергетиката (електроцентрали), минното дело и водоснабдяването и канализацията. Тези замърсители оказват влияние на природата. Докато за пречистването от тях са разработени различни физико-химични процеси, тези подходи често се оказват прекалено скъпи, неспецифични или с потенциал да отделят вторично замърсяване. Микробните популации обаче също могат да разграждат замърсители и се разглеждат като екологично чист и икономически ефективен метод за възстановяване на екологичните ниши, замърсени с химични вещества. В резултат на това се наблюдава нарастващ интерес към екологично чисти биологични методи за пречистване, познати под термина биоремедиация. Въпреки че биоремедиацията се използва в различна степен вече над 60 години, например лендфармингът на нефтени въглеводороди в почвата, в исторически план тя е била прилагана като инженерно решение „черна кутия“, където се добавят изменения и замърсителите се разграждат. В много случаи този подход има успех, но много често резултатите са далеч от задоволителни, тоест замърсителят не се разгражда или дори се произвеждат по-токсични дъщерни продукти. Ключът към успешната биоремедиация е да се впрегне естествената катаболитна активност на микроорганизмите за катализиране на трансформациите на замърсителите на околната среда.

Биоремедиация

Биоремедиацията представлява експлоатиране на биологичните активности за смекчаване (или при възможност напълно елиминиране) на вредните ефекти, предизвикани от замърсителите на околната среда на определени места. Ако процесът протича на самото място, засегнато от замърсяване, тогава сценарият за биоремедиация е in situ. Обратно, умишленото релокализиране на замърсения материал (почва и води) на различно място за по-интензивна биокатализа води до решение ex situ. При биоремедиацията микроорганизмите, проявяващи биологична активност, включително алги, бактерии, фунги и дрожди, могат да се използват в естествено срещаните им форми.

Фигура 1. Микроорганизми, използвани за целите на биоремедиацията (Coelho et al. 2015).

Фигура 1. Микроорганизми, използвани за целите на биоремедиацията (Coelho et al. 2015).

На Фигура 1 са представени главните групи микроорганизми, прилагани при тези процеси, въз основа на преглед на литературата, посветена на изследвания на микроорганизми и биоремедиация. Най-широко използваните микрооргаризми са бактерии и фунги, но дрождите и алгите също намират често приложение.

Микроорганизми, използвани за биоремедиация

Обикновено биоремедиацията се основава на кометаболитното действие на един организъм или на консорциум от микроорганизми. При този процес трансформацията на замърсители има ниска ефективност или не носи полза за клетката, поради което се нарича неносеща полза биотранформация. Няколко изследвания показват, че много организми (прокариотни и еукариотни) притежават естествена способност за биосорбция на токсични йони на тежки метали. Като примери за микроорганизми, проучвани и стратегически използвани за биоремедиация могат да се посочат следните: (1) бактерии: Arthrobacter spp., Pseudomonas veronii (Vullo et al. 2008), Burkholderia spp., Kocuria flava, Bacillus cereus и Sporosarcina; (2) фунги: Penicillium canescens, Aspergillus versicolor и Aspergillus fumigatus; (3) алги: Cladophora fascicularis, Spirogyra spp. и Cladophora spp. и Spirogyra spp. и Spirullina spp. и (4) дрожди: Saccharomyces cerevisiae and Candida utilis. Прокариотите (бактерии и археи) се отличавт от еукариотите (протисти, растения, фунги и животни). Клетъчната структура на еукариотите се характеризира с наличието на ядро и други мембранни органели. Също така, рибозомите при прокариотите са с по-малки размери (70S), отколкото при еукариотите (80S). Начинът, по който микроорганизмите взаимодействат с йоните на тежките метали, частично зависи от това дали те са еукариоти или прокариоти, като еукариотите са по-чувствителни от прокариотите към токсичността на металите. Възможните начини на взаимодействие включват: (а) активно екструдиране на метал, (б) вътреклетъчно хелиране (при еукариоти) с различни пептиди, свързващи метали, и (в) трансформиране до други химични форми с по-ниска токсичност. За да бъде ефективна биоремедиацията, микроорганизмите трябва да атакуват замърсителите с помощта на ензими и да ги преобразуват до безвредни продукти. Бактериите и висшите организми са развили механизми, асоциирани с устойчивост към токсични метали и превръщащи ги в безвредни. Няколко микроорганизма, включително аероби, анаероби и фунги, участват в процеса на ензимнокатализирано разграждане. Болшинството системи за биоремедиация работят в аеробни условия, но анаеробните позволяват на микроорганизмите да разграждат иначе устойчиви молекули. Тъй като на едно място може да присъстват няколко различни вида замърсители, за ефективна ремедиация са необходими различни микроорганизми. Някои микроорганизми могат да разграждат нефтени въглеводороди и да ги използват като източник на въглерод и енергия. Избират се обаче различни организми в зависимост от химичната природа на замърсителите и то внимателно, тъй като те преживяват само при наличието на ограничен набор химични замърсители. Ефективността на деградационния процес е свързана с потенциала на конкретния микроорганизъм да включва молекулен кислород в молекулата на въглеводорода и да генерира междинни съединения, които впоследствие се включват в общия път на енергийния метаболизъм на клетката. Някои бактерии „откриват“ замърсителя и се придвиждат към него, защото притежават гъвкав потенциал като хемотаксисен отговор. Редица микроорганизми могат да използват нефта като хранителен източник, а много от тях произвеждат мощни повърхностно активни вещества, които могат да емулгират нефта във вода и подпомагат отстраняването му. Бактериите, които могат да разграждат нефтопродукти, включват видове от родовете Pseudomonas, Aeromonas, Moraxella, Beijerinckia, Flavobacteria, Chrobacteria, Nocardia, Corynebacteria, Modococci, Streptomyces, Bacilli, Arthrobacter, Aeromonas и цианобактерии и някои дрожди. Например Pseudomonas putida MHF 7109 се изолира от микробни консорциуми на кравешка тор за биодеградация на определени нефтени въглеводороди, като бензен, толуен и o-ксилен (BTX).

Стратеги за биоремедиация

В много случаи почистването на замърсени участъци се извършва с физически и химически методи, като имобилизация, отстраняване (изгребване и депониране), обработване с температура или солвенти. С развитието в областта на биотехнологиите обаче биват разработени биологични методи за разграждане и отстраняване на замърсители – процес, наречен биоремедиация. Тя е потенциално по-евтина от химическите и физическите варианти и може по-ефективно да се справи с по-ниски концентрации контаминанти, въпреки че процесът отнема по-дълго време.

Стратегиите за биоремедиация както при почва, така и при води, са следните:

  • използване на локалната микробна популация;
  • стимулиране на локалната популация;
  • биоаугментация; добавянето на адаптирани или проектирани инокулати;
  • добавяне на генномодифицирани микроорганизи;
  • фиторемедиация.

Ако процесът протича на самото място, засегнато от замърсяване, то сценарият на биоремедиацията е in situ. Обратно, целенасоченото преместване на замърсения материал (почва или води) на различно място за интензивна биокатализа инициира ex situ вариант.

Методи in situ и ex situ

Технологиите за биоремедиация се класифицират най-общо като ex situ и in situ. Ex situ са тези методи, които включват физическо отстраняване на замърсения материал за целта на преработката.

Ако процесът протича на самото място, засегнато от замърсяване, то сценарият на биоремедиацията е in situ. Като цяло, тези методи са най-предпочитените варианти, заради ниската цена и по-ограничената интервенция, тъй като осигуряват обработване на място, без екскавация и транспортиране на замърсителите. Третирането in situ е ограничено от дълбочината на почвата, която може да бъде ефективно преработвана. При много видове почви ефективната дифузия на кислород за желаните скорости на биоромедиация достига на дълбочина от едва няколко сантиметра до около 30 cm, макар в някои случаи да е постигано ефективно третиране и на по-големи дълбочини. Най-важните методи за пречистване на земя са:

Биовентилирането е най-широкоразпространеният метод за пречистване in situ и включва подаване на въздух и хранителни вещества през кладенци в замърсената почва, за да се стимулират естествените бактерии. При биовентилирането се използват ниски скорости на подаване на въдушния поток и са осигурява само това количество кислород, което е необходимо за биоремедиацията, като същевременно се свежда до минимум изпаряването и отделянето на замърсители в атмосферата. Методът е приложим за прости въглеводороди и може да се използва на места, където замърсяването е дълбоко под повърхността.

Биодеградацията in situ е свързана с подаване на кислород и хранителни вещества чрез водни разтвори, циркулиращи през замърсените почви, с цел стимулиране на естествено присъстващите бактерии да разграждат органични замърсители. Този метод се прилага за почви и подпочвени води. Най-общо той включва условия като инфилтрация на вода, съдържаща хранителни вещества, и кислород или други акцептори на електрони за пречистване на подпочвени води.

Биобарботирането се основава на инжектиране на въдух под налягане под нивото на водата, за да се повиши концентрацята на кислород в подпочвените води и да се ускори биодеградацията на замърсители от естествено присъсващите бактерии. Биобарботирането увеличава смесването на наситената зона и така разширява контакта между почвата и подпочвените води. Лесното и евтино инсталиране на точки с малък диаметър за инжектиране на възух позволява значителна гъвкавост при проектирането и изгражането на системата.

Биоаугментацията често включва внасяне на микроорганизми, които се откриват естествено, или се явяват екзогенни за замърсения терен. Два фактора ограничават приложението на метода за добавяне на микробни култури в пречиствания парцел земя: 1) културите, които не се срещат естествено, рядко успяват да се конкурират достатъчно добре с естествените популации, за да могат да се развият и да постигнат устойчива популация с необходимата численост и 2) в повечето почви, продължително подложени на изхвърляне на биоразградими отпадъци, естествено присъстват микроорганизми, които разграждат ефективно, ако пречистваният парцел земя се управлява добре.

Биоремедиацията ex situ чрез умишлено преместване на замърсения материал (почва или вода) на друго място за интензивна биокатализа инициира ex situ вариант. Тези методи включват екскавация или отстраняване на замърсената почва.

Култивирането на земя в контролирани условия (ландфарминг) е прост метод, при който замърсената почва се екскавира и се разстила върху предварително подготвена подложка и периодично се разорава докато замърсителите не се разградят. Целта е да се стимулират естествените биоразграждащи организми и да се способства осъществяваното от тях аеробно разлагане на замърсителите. Като цяло, приложението се ограничава до обработка на повърхностните 10–35 см почва. Тъй като култивирането на земя в контролирани условия (ландфарминг) има потенциала да намали разходите за мониторинг и поддръжка, както и пасивите, свързани с почистването, този метод привлича голямо внимание като алтернативен метод за депониране.

Компостирането е метод, който включва комбиниране на замърсената почва с неопасни органични подобрители, като животински тор или селскостопански отпадъци. Наличието на тази органична материя подпомага развитието на богата микробна популация и повишаването на температурата, типично за компостирането.

Биокупчините представляват хибриден подход между ландфарминга и компостирането. Най-общо, конструират се клетки като аерирани компостни купчини. Обикновено използвани за пречистване на повърхностни замърсявания с нефтени въглеводороди, те се явяват усъвършенстван вариант на култивирането на земя в контролирани условия, насочен към ограничаване на физическите загуби на замърсители, дължащи се на просмукване и изпарение. Биокупчините предоставят благоприятна среда за естествено присъстващите аеробни и анаеробни микроорганизми.

Биореактори. Суспензионни биореактори или биореактори в течна фаза намират приложение за ex situ пречистване на замърсени почви и води, изпомпвани от замърсени струи. Биоремедиацията в реактори включва обработване на материал в твърда фаза (почва, седимент, шлам) или вода чрез проектирана система от камери. Суспензионният биореактор може да се определи като контейнер и апарат, използван за създаване на трифазни условия (твърдо, течно и газообразно) на смесване за увеличаване на скоростта на биоремедиацията на свързани с почвата и водоразтворими замърсители, като водна суспензия от замърсена почва и биомаса (обикновено естествено присъстващи микроорганизми), способни да разграждат целевите замърсители. Като цяло, скоростта и степента на биодеградацията са по-добри в биореакторната система, отколкото in situ или при системите в твърда фаза, защото средата в контейнерите е по-лесна за управляване и следователно, по-контролируема и по-предсказуема. Въпреки предимствата, биореакторните системи имат и някои недостатъци. Преди да бъде поставена в биореактора, замърсената почва изисква предварителна обработка (напр. екскавация) или пък отделяне на замърсителя от почвата чрез промиване или физична екстракция (напр. вакуумна екстракция). Таблица 1 обобщава стратегиите за биоремедиация.

Таблица 1. Обобщение на стратегиите за биоремедиация

Технология Примери Предимства Ограничения Важни фактори
In situ In situ биоремедиация Биобарботиране Биовентилиране Биоаугментация Най-рентабилни Неинвазивни Относително пасивни Екологични ограничения Отнемат продължително време Труден мониторинг Биодеградиционен потенциал на естествено присъстващите микроорганизми Присъствие на метали и други неорганични вещества Фактори на средата Биоразградимост на замърсителите Химична разтворимост Геологични фактори Разпределение на замърсителите
Естествени процеси на разреждане
Приложими за води и почви
Ex situ Ландфарминг Компостиране Биокупчини Рентабилни Изисквания за пространство Отнемат продължително време Вж. по-горе
Ниски разходи Небходимост от ограничаване на абиотичните загуби
Могат да се извършат на място Проблем с масопреноса Ограничения на бионаличността
Биореактори Суспензионни реактори Бърза кинетика на разграждане Оптимизирани параметри на средата Подобрен масопренос Ефективно използване на инокулати и сърфактанти Изискват екскавация на почвата Вж. по-горе Биоаугментация
Реактори в течна фаза Относително високи капиталови разходи Сравнително високи експлоатационни разходи Токсичност на добавките Токсични концентрации на замърсителите

Предимства и недостатъци на биоремедиацията

Предимства

  • Биоремедиацията е природен процес и следователно се възприема от широката общественост като приемлив подход за пречистване на замърсени материали като почви. Микроорганизмите, способни да разграждат замърсителя, нарастват по численост, когато той присъства, а когато се разгради, популацията им намалява. Остатъчните продукти след пречистването обикновено са безвредни и включват въглероден диоксид, вода и клетъчна биомаса.
  • Теоретично, биоремедиацията е приложима за пълното разрушаване на множество различни замърсители. Редица съединения, които са официално признати за опасни, могат да бъдат преобразувани до безвредни продукти. Това елиминира вероятността за последваща отговорност, свързана с обработката и обезвреждането на замърсени материали.
  • Вместо дадените замърсители да се прехвърлят от една екологична среда в друга, например от почва във вода или въздух, те могат да бъдат изцяло разрушени.
  • Биоремедиацията в много случаи може да се извършва на място, често без да се причинява значително смущаване на нормалните активности. Това елиминира и необходимостта от пренасяне на отпадъците на друго място, както и потенциалните заплахи за здравето на хората и околната среда, които биха могли да произтекат по време на транспортирането.
  • Биоремедиацията може да струва по-евтино от други технологии, използвани за очистване на опасни отпадъци.

Недостатъци

  • Биоремедиацията се огарничава до онези съединения, които са биоразградими. Не всички съединения са податливи на бързо и пълно разграждане.
  • Съществуват известни притеснения, че продуктите от биодеградацията могат да бъдат по-устойчиви или по-токсични от изходното съединение.
  • В много случаи биологичните процеси са много специфични. Сред важните фактори на средата, нужни за успеха, са наличието на микробни популации с подходящ метаболизъм, благоприятни екологични условия за растеж и нива на хранителни вещества и замърсители.
  • Трудно се екстраполира от лабораторните и пилотните изследвания към пълномащабни полеви действия.
  • Необходими са проучвания за разработване и проектиране на биоремедиационни технологии, подходящи за места със сложни смеси от замърсители, които не са равномерно разпределени в околната среда.
  • Замърсителите могат да фигурират в твърдо, течно или газообразно състояние.
  • Биоремедиацията в много случаи отнема по-дълго време, отколкото други методи за пречистване, като екскавация и отстраняване на почвата или изгаряне.
  • Няма общоприета дефиниция за „чист“, поради което е трудно да се даде оценка на ефективността на биоремедиацията, също така няма възприети критерии за пречистванията чрез биоремедиация (Vidali, 2001).

Фактори на средата от значение за биоремедиацията

Хранителни вещества

Въпреки че в замърсените почви присъстват микроорганизми, те не са винаги с необходимата численост за биоремедиация на конкретното място. Растежът и активността им трябва да бъдат стимулирани. Биостимулацията обикновено включва добавяне на хранителни вещества и кислород за подпомагане на естествено присъстващите микроорганизми. Тези хранителни вещества са основните градивни единици на живота и поздоляват на микробите да произведат необходимите ензими за разграждането на замърсителите. Всички те се нуждаят от азот, фосфор и въглерод. Въглеродът е най-основният елемент за живите организми и е необходим в по-големи количества от другите елементи. Наред с водорода, кислорода и азота, той съставлява около 95% от масата на клетките.

Фосфорът и сярата допринасят за 70% от остатъка. Хранителните изисквания за съотношението въглерод към азот са 10:1, а за въглерод към фосфор – 30:1.

Изисквания към факторите на околната среда

Растежът и активността на микроорганизмите силно зависят от стойностите на pH, температурата и влажността. Въпреки че микроорганизми се изолират и от екстремни ниши, болшинството се развиват оптимално в тесен диапазон, поради което е важно да се постигнат оптимални условия. Ако почвата съдържа прекалено много киселини, съществува възможност стойностите на pH да се балансират чрез добавяне на вар. Температурата оказва влияние на скоростта на биохимичните реакции, като скоростите на много от тях се удвояват при всяко нарастване на температурата с 10 °C. Над определена температура обаче клетките умират. За по-добро загряване от слънчевите лъчи през късната пролет, лятото и есента може да се практикува покриване с пластмасов материал. Наличната вода е от съществено значение за всички живи организми, като за постигане на оптималното ниво на влага е необходимо напояване. Количеството наличен кислород се явява определящо за това дали системата е аеробна или анаеробна. Въглеводородите са лесно податливи на разграждане при аеробни условия, докато хлорираните съединения се разграждат единствено при анаеробни. За повишаване на количеството кислород почвата може да се разорава или да се барботира въздух. В някои случаи в средата се внасят водороден пероксид или магнезиев пероксид. Структурата на почвите е определяща за ефективното внасяне на въздух, вода и хранителни вещества. За подобряване на почвената структура се използват материали като гипс или органика. Слабата почвена пропускливост затруднява движението на водата, хранителните вещества и кислорода; следователно почвите със слаба пропускливост понякога не са подходящи за прилагане на методите за пречистване in situ.

Влияние на факторите на средата върху биоремедиацията

По-ранните изследвания с опити за биоремедиация не са били провеждани при естествени условия на средата. Поради това не се е знаело какво влияние на факторите на средата върху процеса на биоремедиация да се очаква. Сега обаче след проучване на подходите за биоремедиация in situ вече е възможно да се установи, че тези фактори имат съществено значение, като физиологичните и химичните характеристики на заобикалящата среда, бионаличността на хранителните вещества, концентрацията и свойствата на други присъстващи замърсители, нивото на замърсяване, организацията на естествените микробни съобщества. Различни абиотични и биотични фактори играят важна роля при биоремедиацията. Динамичните им взаимодействия се осъществяват при конкретни абиотични условия, които се определят от физико-химичните фактори, като наличие на O2, електронен транспорт, вода, температура, pH, концентрация на соли. Изброените фактори на средата определят динамиката на структурата на естествените микробни съобщества, наред с наличността на дадени източници на химични вечества или енергия.

Факторите, които са от значение при сценариите за биоремедиация, включват множество елементи, а не само биологичните катализатори и дискутираните по-горе замърсители. Динамичните им взаимодействия се осъществяват при конкретни абиотични условия, които се определят от физико-химичните фактори: парциалното налягане на O2, електронните акцептори, вода, температура, гранулиране и други, много от които се променят във времето и в хода на катализата. Тези абиотични условия определят видовия състав на естествените микробни съобщества, колкото и (или дори повече от) наличността на дадено химично вещество като източник на C или на енергия. Биоремедиацията е процес с многостепенна сложност, който не се поддава лесно на типичните редукционистки подходи (напр. едно съединение, един щам и един биохимичен път), които доминират сред изследванията в областта на биоремедиацията. Как да се преодолее тази безизходица?

Тъй като микроорганизмите са движещата сила на биоремедиацията, промените в състава и активността на микробното съобщество могат да повлияят съдбата на замърситела в околната среда. Новите изследвания прилагат подходи за секвениране от ново поколение за по-добър поглед върху микробните съобщества, участващи в различните биоремедиационни интервенции. Тези подходи са разширили значително познанията ни за микробиологичните процеси, свързани с биоремедиацията, както и за влиянието на различните стратегии за отговор при очистване от замърсители. Молекулярната биология и метагеномиката също допринасят значително за обогатяване на разбиранията ни за биологичните системи, намиращи се в замърсените среди, и в много случаи съществено подобряват схващанията ни за света на микроорганизмите. Ето защо се стремим да предоставим основния фон за метагеномните подходи и да обобщим как са прилагани тези инструменти за разбиране на замърсените среди като част от усилията да получим информация за най-добрите практики за очистване на околната среда.

Биоремедиацията изисква интегриране на огромни количества данни от различни източници: химична структура и реактивоспособност на органичните съединения; секвенция, структура и функция на белтъците (ензимите); сравнителна геномика; микробиология на оклоната среда и т.н.

Системна биология

Процесът на биоремедиация използва микробно съобщество за очистване на околната среда от даден замърсител. Скоростта на детоксификация зависи от редица фактори, включително от състава на естественото микробно съобщество, условията на средата и природата на замърсителя. Ето защо оптимизацията на биоремедиацията изисква съчетаване на сложни променливи за разкриване и предвиждане на съдбата на замърсителите на околната среда. Системната биология – науката за системните свойства и динамичните взаимодействия в една биологична система, се занимава с изясняване на сложните биологични системи и на това как те отговарят на различни смущения. Системнобиологичният подход за изучаване на екологичните системи и биоремедиацията се прилага за изследване на сложните микробни съобщества в околната среда и екологичните ограничения при разграждането на замърсителите.

Има нужда от изследвания in silico с различни изчислителни инструменти за предвиждане на възможните пътища за разграждане. Съществуват голям брой бази данни и компютърни програми за извършване на изчислителен анализ за подпомагане на разработването и прилагането на микробна биоремедиация. Огромното количество биологични данни главно под формата на ДНК, РНК и белтъчни секвенции определя голямо търсене на компютри и учени в областта на изчислителните технологии. Системната биология е интегриран подход за изследвания на сложни биологични системи чрез проучване на взаимодействията и мрежите на ниво молекули, клетки, съобщества и екосистеми. Системнобиологичният подход се прилага за разкриване на ключови процеси за изясняването, оптимизирането, предвиждането и оценяването на микробните функции и стратегии за оцеляване в дадена екосистема. За да се приложи системнобиологичният подход при проектите за биоремедиация, те трябва да включват охарактеризиране на състава на микробното съобщество, клетъчната и молекулярната активност, което се усложнява от наличието на токсични съединения, променящи нормалното поведение на микробното съобщество.

Сред важните компоненти на системната биология се нареждат прилагането на изчислителни подходи за развиване на схващания за предвиждане на отговора на системите и познания за ремедиацията на замърсителя, като се комбинират множество системни нива за предвиждане на съдбата на замърсителите на оклната среда.

Силно се вярва, че има три измерения за ефективността на същинския процес на биоремедиация; тоест, химичният пейзаж (бъдещите хранителни вещества, донори и акцептори на електрони и стресови фактори), абиотичният пейзаж и катаболитният пейзаж, от които единствено катаболитният е биологичен по същество. Химичният пейзаж има динамично взаимодействие с биологичните интервенции на абиотичния фон на засегнатото място. Тук се включват влажността, проводимостта, температурата, условията на почвената матрица, окислително-редукционният статус и т.н.

Фигура 2. Връзки на системната биология с биоремедиацията (Koehmel et al. 2016)

Фигура 2. Връзки на системната биология с биоремедиацията (Koehmel et al. 2016)

За да се добие представа за сложните процеси на биоремедиацията in situ, могат да се предоставят безпрецедентни разкрития относно участващите ключови микробиологични реакции чрез методи за мониторинг, които описват и наблюдават крайните донори и акцептори на електрони, ензимни сонди, измерващи функционалната активност на средата, микрочипове за функционална геномика и филогенетика, метаболомика, протеомика и количествена полимеразна верижна реакция (англ. quantitative PCR; б. пр.) (Фигура 3). Най-общо екосистемата се състои от съобщества, популации, клетки, белтъци, РНК и ДНК. Можем да анализираме ДНК, РНК и белтъците на клетъчно ниво, за да добием представа за влиянието на клетките и да анализираме съобществото и популациите за изясняване на ефекта на биоремедиацията върху връзките структура/функция (Фигура 3).

Фигура 3. Системна биология от молекули към екосистеми

Фигура 3. Системна биология от молекули към екосистеми

Една биологична система може да бъде изучавана на системно ниво чрез изследване на четири ключови свойства:

1) Структури на системата. Те включват мрежата от генни взаимодействия и биохимични пътища, както и механизмите, по които тези взаимодействия модулират физичните свойства на вътреклетъчните и многоклетъчните структури.

2) Динамика на системата. Какво е поведението на системата във времето при различни условия, може да се установи чрез методи за метаболитен анализ, анализ на чувствителността, динамичен анализ като фазов портрет и бифуркационен анализ или чрез идентифициране на основните механизми, определящи определени типове поведение. Бифуркационният анализ проследява вариращите във времето промени (или промяна) на състоянието на системата в многоизмерно пространство, където всяко измерение представлява определена концентрация на участващия биохимичен фактор.

3) Метод на контролирането. Механизмите, които системно контролират състоянието на клетката, могат да бъдат модулирани, за да се сведат до минимум проблемите и да се осигурят потенциални терапевтични таргети за лечение на заболявания.

4) Метод на проектирането. Могат да бъдат съставени стратегии за модифициране и конструиране на биологични системи с желаните свойства въз основа на определени принципи на проектиране и симулации, вместо на сляпо, чрез проба и грешка.

Напредъкът във всяка една от по-горните области изисква важни научни открития относно схващанията ни за изчислителните науки, геномиката и измервателните технологии и интеграция на тези постижения с наличните познания.

„Омиксните“ подходи заемат централно място в областта на системната биология. Метагеномиката – анализът на общото геномно съдържание на едно микробно съобщество, се прилага широко за изучаване на микробните съобщества в екологичните системи (Фигура 4). През последните години за микробните съобщества в околната среда се прилагат други „омиксни“ технологи, включително метатранскриптомика (анализ на РНК на ниво съобщество) и метапротеомика (анализ на белтъците на ниво съобщество).

Множество подходи могат да се впрегнат за изучаване на различните нива на едно микробно съобщество. Всеки един от тези методи изследва определени биологични молекули (ДНК, РНК или белтъци); пълният анализ на всяка от тези молекули, извлечени от едно екологично съобщество, дава ключова представа за таксономичния състав, функционалния потенциал на съобществото или за гените и белтъците, които се екпресират в конкретния момент (Techtman and Hazen, 2016).

Метагеномика

Геномиката е мощна компютърна технология, която се прилага за изясняване на структурата и функцията на всички гени в един организъм въз основа на данни за цялата му ДНК секвенция. Тази област включва интензивни усилия за определяне на цялата ДНК секвенция на даден организъм и фино генетично картиране. Метагеномиката е наука за геномите в едно микробно съобщество и представлява първата стъпка от изучаването на микробиома. Метагеномиката позволява да се изследва съставът на микробното съобщество. Генмните изследвания разглеждат генетичния материал на определен организъм, докато метагеномиката („мета“ означава отвъд) – генетичния материал на цели съобщества от организми. Този процес обикновено включва секвениране от ново поколение (NGS) след екстракция на ДНК от пробите. NGS генерира голям обем от данни под формата на къси секвенции, от които може да се „сглоби“ профилът на микробното съобщество или да се извлече друга информация, съвсем както се редят парчета от пъзел. Въпреки че секвенирането на цели метагеноми (англ. whole-metagenome sequencing (WMS); б.пр.) предоставя частичен поглед върху функционалния профил на микробното съобщество, по-добър подход е метатранскриптомиката, която включва секвениране на целия (мета)транскриптом на микробното съобщество. Метагеномиката предоставя достъп до функционалния генен състав на микробните съобщества и така дава много по-широко описание, отколкото филогенетичните изследвания, които обикновено се основават на разнообразието на само един ген, например този, кодиращ 16S рРНК. Сама по себе си метагеномиката предоставя генетична информация за потенциално нови биокатализатори или ензими, геномни връзки между функция и филогения при некултивирани организми и еволюционни профили на функцията и структурата на съобществата. Може да се допълни и с подходите на метатранскриптомиката и метапротеомиката за описване на експресираните активности. Метагеномиката се явява също и мощен инструмент за съставяне на нави хипотези за микробните фукнкции; за това свидетелстват невероятните открития на фотохетеротрофността с участието на протеородопсин и на окисляващите амоняк археи. Бързото и съществено поевтиняване на секвенирането от ново поколение доведе до забележително ускоряване на развитието на секвенционната метагеномика. Всъщност през последните няколко години се наблюдава експлозивно нарастване на броя метагеномни набори от данни за секвенции, получени по метода „пушка“. В бъдеще метагеномиката ще се използва за описване на профилите на микробните съобщества по същия начин като методите за фингъпринтинг въз основа на гена за 16S рРНК. Следователно тя ще се превърне в стандартен инструмент за редица лаборатории и учени, работещи в областта на микробиологията на околната среда.

Метагеномните подходи обикновено биват два вида: таргетирана метагеномика или метагеномика по метода „пушка“ (Фигура 4). При таргетираната метагеномика – или микробиомика, се изследва генетичното разнообразие на един-единствен ген, за да се определи пълният набор от секвенции на този ген в дадена екологична среда. Таргетираната метагеномика се прилага най-често за проучване както на филогенетичното разнообразие, така и на относителното изобилие на даден ген в дадена проба. Този подход се използва редовно за изследване на генетичното разнообразие на секвенциите на рРНК на малката субединица (16S/18S рРНК) в пробата. В микробиологията на околната среда секвенирането на рРНК на малката субединица е рутинна практика при определяне на таксономичното разнообразие на средата. Намира приложение и като инструмент за изследване на влиянието на замърсители на околната среда за промяната на структурата на микробните съобщества. При таргетираната метагеномика първо се изолира ДНК и избраният ген се амплифицира чрез полимеразна верижна реакция (PCR) с праймери, създадени да амплифицират възможно най-голямо разнообразие от секвенции на този ген. Силата на метагеномиката е в това, че предоставя сравнително изчерпателен каталог на микроорганизмовите таксони, присъстващи в група проби, и дава възможност да се направи задълбочено съпоставяне на промените в микробното разнообразие преди и след дадено въздействие.

Фигура 4. Метагеномни подходи за изучаване на микробните съобщества

Фигура 4. Метагеномни подходи за изучаване на микробните съобщества

При метагеномиката по метода „пушка“ чрез геномно секвениране се определя целият геномен набор на дадено съобщество в околната среда (Фигура 4). При този подход ДНК се изолира от средата, след което се фрагментира, за да се приготвят библиотеки от секвенции. После тези библиотеки се секвенират, за да се определи общото геномно съдържание на пробата. Метагеномиката по метода „пушка“ е мощен метод, при който може да се разкрие функционалният потенциал на микробното съобщество.

Метагеномиката по метода „пушка“ обикновено се лимитира най-много от дълбочината на секвенирането. Разработени са методи, основаващи се на микрочипове. Двете най-широко използвани микрочипови технологии са PhyloChip и GeoChip. PhyloChip е микрочип за 16S рРНК за определяне на разнообразието на 10993 подсемейства, спадащи към 147 таксономични типа (Hazen et al. 2010). GeoChip е функционален микрочип за определяне на разнообразието на 152414 гена от 410 категории гени. Микрочиповите методи дават подробна информация за микробните съобщества без да зависят от дълбочината на секвениране. Друго тяхно предимство е, че предоставят точна анотация на различните таксони/гени, присъстващи на чипа, като по този начин избягват ограничението, дължащо се на необходимостта от добри хомолзи в базата данни за постигане на точно класификациране. Микрочиповите подходи обаче са лимитирани по отношение на това, че могат да откриват само гените върху микрочипа, което възпира потенциала за откриване на нови гени и пътища в пробите. Микрочиповете обикновено се явяват полезно допълнение към секвенционните подходи, като допълнителен източник на данни.

Метатранскриптомика–метапротеомика–метаболомика

С помощта на протеомния подход физиологичните изменения в микроорганизмите по време на биоремедиацията дават допълнителна яснота относно гените, имащи отношение към биоремедиацията, и тяхната регулация. Метатранскриптомиката и метапротеомиката се прилагат все повече за екологичните системи (Фигура 4). Тези подходи предоставят ключова информация за активно експресираните гени в едно микробно съобщество и следователно са добри показатели за микробните функции, които се експресират при условията, съществуващи в момента на вземане на пробата. При метатранскриптомиката се изолира РНК от проба, взета от околната среда. Тази РНК се прекопира в кДНК и се секвенира по подобен начин като при метагеномиката (Фигура 4). Този подход дава набора от активно експресираните гени в пробата. Метапротеомиката не включва секвениране на нуклеинови киселини, а мас-спектрометрия с висока разделителна способност, съчетана с ензимно протеолитично разкъсване на белтъците или липидна хроматография. Метапротеомиката предоставя поглед върху набора белтъци, намиращи се в пробата от околната среда, включително посттранслационните модификации, които могат да повлияят тяхната активност.

Като поставя фокуса върху това кои гени се експресират от цялото микробно съобщество, метатранскриптомиката хвърля светлина върху активния функционален профил на това съобщество. Метатранскриптомът предоставя „снимка“ на генната експресия в дадена проба в определен момент от време и при специфични условия, като „улавя“ общата иРНК. Що се отнася до метагеномиката, вече е възможно да се извърши секвениране по метода на „пушката“ на цели метатранскриптоми. Тази цялостна (мета)геномна експресия разкрива експресионния и функционалния профил на един микробиом. Когато се обработват секвенциите, типичните стъпки на метатранскриптомния анализ включват или (1) картиране на първичните секвенции спрямо някой референтен геном, или (2) сглобяване на първичните секвенции de novo до траскриптни контиги и суперконтиги. При първата стратегия, подобно на методите, основаващи се на алайнмънти при WMS, се прави картиране спрямо референтни бази данни, като по този начин се събира информация за относителната експресия на отделни гени. При втората стратегия се получава същата информация, но с помощта на асемблирани секвенции. Ограничение на първата стратегия е информацията в базата данни от референтни геноми. А на втората – способността на софтуерните програми коректно да асемблират контиги и суперконтиги от къси първични секвенции. Метатранскриптомиката намира значително по-рядко приложение при изучаването на микробиома в сравнение с останалите „омиксни“ технологии, разгледани тук. Болшинството пайплайни на анализите, описани в литературата, се съставят ad hoc. Повечето от тези методи следват първата от двете стратегии, упоменати по-горе, основаваща се на картиране на първичните секвенции.

Метаболомиката е задълбочен анализ, при който се идентифицират всички метаболити в една проба (малки молекули, отделяни от организма в непосредствено заобикалящата го среда) и се определят техните количества. Метаболомът се смята за най-директния показател за състоянието на средата или за измененията в хомеостазата (т.е. дисбиоза). Вариациите в произвежданите сигнатурни метаболити са свързани с промени в активността на метаболитните пътища и следователно метаболомиката се явява подход, приложим за анализ на биохимичните пътища. Освен това, метаболомиката в областта на разработването на лекарства и фармакогеномиката разкрива многообещаващи хоризонти за персонализираната медицина. Метаболомните профили, свързани с микробиома, показват силна зависимост от факторите на средата (напр. начин на хранене, досег с ксенобиотици и стресови фактори), с което предоставят ценна информация не само за характеристиките на микробиома, но и за взаимодействията на микробното съобщество със заобикалящата среда. По този начин метаболомиката има за цел да подобри нашите познания за ролята на микробиома при трансформацията на хранителни вещества и замърсители, както и да други абиотични фактори, които оказват влияние на хомеостазата на околната среда. Анализите на спектралните метаболомни данни включват три последователни стъпки: (1) предварителна обработка, (2) статистически анализ и (3) методи за машинно обучение за разпознаване на патерни. При първата стъпка качеството на данните, които предстои да бъдат анализирани, се подобрява чрез елиминиране на шума и подбиране на пикове.

Разработени са няколко in silico софтуери, пайплайни, уебресурси и алгоритми за интерпретация или корелиране на молекулярни и „x-омиксни“ данни. Въпрети това биоинформатичните ресурси за целите на биоремедиацията са все още оскъдни. Базата данни за биокатализа/биоремедиация към Университета на Минесота (University of Minnesota Biocatalysis/Biodegradation Database (UMBBD)) съдържа 200 пътя, 1350 реакции, >1000 ензима, 491 микроорганизми и 259 правила за биотрансформация, обхнащащи микробиологичната биоремедиация (http://umbbd.msi.umn.edu/) (Gao et al. 2011). Metarouter е още една система за поддържане на хетерогенна информация, свързана с биоремедиацията и биодеградацията, в рамка, която позволява актуализиране на модификациите на заявките (Desai et al. 2010). Системата може да се оценява и администрира посредством уебинтерфейс (Pazos et al. 2005). Други софтуерни платформи са: Киотската енциклопедия на гените и геномите (KEGG) с адрес http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg.html (Moriya et al. 2010); Биохимичните пътища на Бьорингер Манхайм (англ. Boehringer Mannheim Biochemical Pathways (BMBP); б.пр.) на сървъра ExPASy, Швейцария (http://www.expasy.org/cgi-bin/search-biochem-index); Международното общество за изследване на ксенобиотиците (англ. International Society for the Study of Xenobiotics; б.пр.) (http://www.issx.org); PathDB; базата данни за метаболитни пътища (англ. Metabolic Pathways Database; б.пр.) при NCGR (http://www.ncgr.org/Pathdb/) и т.н.

Съществуващите изчислителни бази данни, софтуерни програми и инструменти и тяхното взаимно интегриране ще спомогне за това да може да се определи съдбата на всяко едно съединение в околната среда с по-голяма точност и акуратност.

Приложение в практиката

Биотрансформация на радионуклиди

Подпочвените води и почвата на „Район 3“ на Центъра за полеви изследвания в Оук Ридж (англ. Area 3 FRC site in Oak Ridge; б.пр.) са не само замърсени с уран (до 200 mM), но и представляват уникален биоремедиационен проблем поради ниските стойности на pH (3) и високите концентрации на нитрати (200 mM) и калциий, наред с наличието на хлорирани органични разтворители. Проучванията на този терен от различни изследователи дават пример за успешното приложение на инструментите на системната биология за разкриване на по-задълбочена представа за микробиологията под повърхността. При предходен анализ на съобществото чрез библиотека на клонирани 16S гени, проведен по време на изпитване за in situ биостимулация на този терен, биват идентифицирани присъстващи Desulfovibrio, Geobacter, Anaeromyxobacter, Desulfosporosinus, Acidovorax и Geothrix spp., наред с редукция на U(VI) (Cardenas et al. 2008). Библиотеките от клонове на функционални генни маркери като dsrAB, nirK, nirS, amoA и pmoA свидетелстват за голямо разнообразие от микроорганизми по отношение на функционални гени. По-нови метагеномни изследвания от кладенец FW106, специално проведени със стратегия са произволно секвениране по метода на „пушката“, разкриват силно набогатено съобщество, доминирано от денитрифициращи β-протеобактерии и γ-протеобактерии. Анализът на няколко кладенеца за мониторинг на подпочвените води с помощта на GeoChip показа голямо разнообразие от dsrAB гени, което подсказва, че ключовата роля при редукцията на U(VI) се пада на сулфатредуциращите бактерии. По време на фазата на реоксидация на U(VI) в седиментна колона с проби от FRC е наблюдавано намаляване на биомасата, но повишаване на микробната активност. След прилагане на PhyloChip не е установено намаляване на числеността на Geobacter или Geothrix spp. по време на фазата на реоксидация, но представителите на Actinobacteria, Firmicutes, Acidobacteria и Desulfovibrionaceae показват завишено изобилие. Анализът на полеви проби с GeoChip по време на фазата на реоксидация разкрива намаляване на dsr гените, но реоксидацията не изглежда да оказва влияние върху функционалното разнообразие на микроорганизмите, което подсказва, че микробното съобщество има способност да се възстановява и да продължава да редуцира U(VI) през постокислителната фаза.

Биоимобилизация на метали

Ханфордската „Зона 100H“, разположена на река Колумбия в щата Вашингтон, е замърсена с хром (Cr) в резултат от това, че е била място за производство на оръжия. През 2004 г., там бива инжектирано отделящото водород съединение (англ. Hydrogen Release Compound; б. пр.) HRC като опит да се предизвика устойчива биоимобилизация на Cr(VI) in situ чрез стимулиране на естествената микрофлора. Hubbard et al. (2008) използват таймлапс сеизмичен и радарен томографски геофизичен мониторинг, за да определят пространствено-времевото разпределение на инжектираното съединение HRC и биогеохимичните трансформации, свързани с биоремедиацията на Cr(VI) след въвеждането на HRC. Директното преброяване на клетки разкрива, че докато числеността им достига 108 клетки/ml, в рамките на една година нивата на Cr(VI) намаляват от 100 ppb до под фоновата концентрация. Анализ с PhyloChip показва обогатяване на сулфатредуциращи бактерии наред с нитратредуциращи, желязоредуциращи бактерии и метаногенни популации през този период от време. Методът на целенасочено набогатяване води до изолиране на сулфатредуциращ Desulfovibrio vulgaris като щам RCH1, нитратредуциращ Pseudomonas stutzeri щам RCH2 и желязоредуциращ Geobacter metallireducens щам RCH3, всички от които способни да редуцират Cr(VI). Анализът чрез mFlowFISH (интегрирана флуоресцентна in situ хибридизация и проточна цитометрия) успява да детектира и сортира псевдомонаси, подобни на щам RCH2 директно от водни проби от Ханфордската „Зона 100H“, събрани през 2009 и 2010 г.

Биоремедиация на въглеводороди

Петролните енергийни източници стимулираха индустриалния растеж и просперитета. Това обаче доведе и до разнасяне на въглеводороди в различни екологични среди. За щастие органичната природа на въглеводородите позволява на микроорганизмите да метаболизират тези нефтени съединения като субстрати. Заслужават внимание обзорите, посветени на системнобиологичния подход за биоремедиация, на Atlas и Hazen (2011), Harayama et al. (2004), Zhou et al. (2011), Fredrickson et al. (2008), de Lorenzo (2008) и Chakraborty et al. (2012). Нефтеният разлив MC252 в Мексиканския залив през 2010 г. е най-големият в историята на САЩ. Редица фактори на средата отличават този разлив от други предходни, включително съставът на въглеводородите, променливите на околната среда, дълбочината на разлива и наличието на системнобиологични инструменти. Информацията от химичните анализи се оказва от изключителна важност за подпомагане на системнобиологичния подход за биоремедиация на нефт при разлива MC252. Докато Camilli et al. (2010) правят заключение, че темпът на микробната респирация в дълбочина е изключително нисък въз основа на концентрацията на разтворен кислород и измервания на микробната респирация, ензимни активности, концентрацията на фосфати и на полярни мембранни липиди в повърхностните води, засегнати от нефтения разлив, Edwards et al. (2011) правят извод, че ензимните активности и темпът на респирация са по-високи във вътрешността на нефтения разлив. Valentine et al. (2010) изучават съдбата на газовете метан, пропан и етан в дълбокия слой въглеводороди на повече от 799 m дълбочина и установяват, че пропан и етан се разграждат по-бързо от метан. Белязани с 13C субстрати, както и маркери, белязани с 13C и 3H, биват използвани за измерване на d13C-DIC (разтворен органичен въглерод; б.пр.). Друго изследване установява, че въглеводородът, изпуснат в най-голямо количество при разлива MC252, е метан и че се наблюдава бърз отговор от страна на метанотрофните бактерии, които бързо усвояват наличния метан. PhyloChip, библиотеки от клонове, GeoChip, фосфолипидни мастни киселини (PLFA) и изотопна химия биват използвани за съпоставяне на микробните съобщества във и извън дълбокия слой (Hazen et al. 2010). Резултатите идентифицират представители на Oceanospirillales, за които се установява, че разграждат въглеводороди при 58°C във вътрешността на дълбокия слой. GeoChip демонстрирал гени, които показват достоверна корелация с концентрацията на нефтени замърсители, като phdC1 (деградация на нафтален) и alkB (оксиление на алкани), както и като изменение на процесите в цикъла на C, N, P и S в пробите от дълбочинния слой. Намесата на федералните агенции и висящите съдебни дела стават стимул за полагане на съгласувани усилия за стиковане на всички събрани данни, в резултат на което бива съставена подробна база данни от полза за изследователите. Благодарение на интегрирането на химичните анализи с проучвания, използващи системнобиологичния подход, става възможно безпрецедентно изясняване почти в реално време на химичните и биологичните реакции, участващи в деградацията на въглеводородите. За добиване на по-цялостна представа за микробиологичните процеси, данните от транскриптомни проучвания ще предоставят информация за това дали култивируемите доминантни микроорганизми са активни in situ, а протеомните изследвания ще идентифицират ензими, ключови за разграждането на въглеводороди.

Биоремедиация на хлорирани разтворители

Хлорираните разтворители като, трихлороетен и дихлороетeн, са трудно разградими канцерогенни съединения, които, веднъж отделени, остават дълго в околната среда. Микроорганизмите, например Dehalococcoides, могат да използват хлорираните разтворители като акцетпори на електрони в анаеробна среда и да ги дехлорират до етен. Друг биодеградационен път е аеробното кометаболизиране на хлорираните съединения до въглероден диоксид и хлорид от микроорганизми, например метанокислители, с помощта на метан монооксигенази (MMO). В няколко обзора са описани методи за мониторинг на загубата на маса, геохимичните фингерпринти, изотопното фракциониране, свързано с биодеградацията, микробните съобщества при биостимулацията, както и за количествена полимеразна верижна реакция в реално време (англ. real-time qPCR; б.пр.), таргетиращ дехалогеназните гени. През периода 1955 г. – 1972 г. слаборадиоактивни изотопи, канални води и хлорирани разтворители биват инжектирани във водоносния хоризонт през кладенец, дълбок 95 m, при Северната тестова зона (англ. Test Area North (TAN); б.пр.) при Националната лаборатория в Айдахо (САЩ) (англ. Idaho National Laboratory; б.пр.). Дълбокият слой съдържа концентрации на трихлороетен, вариращи от 5 ppb до 300 ppm, простиращи се на повече от 2 km. През 1999 г. започва пилотно проучване за интензивна in situ биоремедиация, имащо за цел да очисти подпочвените води, замърсени с хлорирани разтворители, чрез инжектиране на електронния донор лактат за стимулиране на редуктивно дехлориране in situ. Направено е съпоставяне на микробните съобщества в пробите от почвата и подпочвените води чрез охарактеризиране на общата биомаса, PLFA анализ, култивиране и физиологично профилиране на ниво съобщество (англ. community-level physiological profiling (CLPP); б.пр.) с помощта на Biolog GN микроплаки (Lehman et al. 2004). Проведеният DGGE анализ подсказва, че кладенците с високи концентрации на хлорирани разтворители съдържат различни микробни съобщества от тези с минимално съдържание на замърсителите, и че прикрепените и свободно живеещите микроорганизми имат различен функционален профил и състав. Освен това, qPCR на гените за 16S рРНК от Dehalococcoides sp. предоставя най-убедителния резултат за количествено определяне на дехлориращия потенциал на дадено съобщество в сравнение с анализа на съобществата чрез полиморфизми в дължината на терминални рестрикционни фрагменти (англ. terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP); б.пр.), и RFLP анализ със секвениране на клоновете. Erwin et al. (2005) разкриват присъствито на бактерии, имащи MMO и потенциал за кометаболизиране на трихлороетен при TAN от една незасегната област, като използват амплификация чрез PCR за създаване на библиотека от фрагменти на функционални гени и тяхното секвениране. Съотношенията на стабилните изотопи на въглерода в пробите подпочвени води, взети през 2000 г., потвърждават, че е настъпило пълно преобразуване на TCE до етен и минимална биодеградация на t-DCE (Song et al. 2002). С помощта на PhyloChip за охарактеризиране на бактериалния състав се наблюдава намаляване на числеността на дехлориращите организми и увеличаване на метанокисляващите микроорганизми, способни да кометаболизират трихлороетен в аеробни условия. По-нататъшни изследвания, които биха допълнили проучванията на зоната TAN, биха включвали прилагане на протеомиксен подход „пушка“, както се съобщава от Werner et al. (2009). Техният метод позволява да се детектират пептиди като FdhA, TceA, PceA и HupL, които потенциално биха могли да служат като биоиндикатори за дехалореспирация на хлориран етен.

Литературни източници

  • Achal V., Pan X., Fu Q., Zhang D. Biomineralization based remediation of As (III) contaminated soil by Sporosarcina ginsengisoli. Journal of Hazardous Materials 2012; 201–202, 178–184.
  • Achal V., Pan X., Zhang D. Remediation of copper-contaminated soil by Kocuria flava CR1, based on microbially induced calcite precipitation. Ecological Engineering 2011; 37 (10) 1601–1605.
  • Alivisatos AP, Blaser MJ, Brodie EL, Chun M, Dangl JL, Donohue TJ, Dorrestein PC, Gilbert JA, Green JL, Jansson JK, Knight R, Maxon ME, McFall-Ngai MJ, Miller JF, Pollard KS, Ruby EG, Taha SA (2015) A unified initiative to harness Earth’s microbiomes. Science 350:507–508. doi:10.1126/science.aac8480
  • Atlas RM, Hazen TC: Oil biodegradation and bioremediation: a tale of the two worst spills in US history. Environ Sci Technol 2011, 45:6709-6715.
  • Beja O, Aravind L, Koonin EV, Suzuki MT, Hadd A, Nguyen LP, Jovanovich SB, Gates CM, Feldman RA, Spudich JL, Spudich EN, DeLong EF: Bacterial rhodopsin: evidence for a new type of phototrophy in the sea. Science 2000, 289(5486):1902-1906.
  • Brodie EL, DeSantis TZ, Joyner DC, Baek SM, Larsen JT, Andersen GL, Hazen TC, Richardson PM, Herman DJ, Tokunaga TK et al.: Application of a high-density oligonucleotide microarray approach to study bacterial population dynamics during uranium reduction and reoxidation. Appl Environ Microbiol 2006, 72:6288-6298
  • Camilli R, Reddy CM, Yoerger DR, Van Mooy BAS, Jakuba MV, Kinsey JC, McIntyre CP, Sylva SP, Maloney JV: Tracking hydrocarbon plume transport and biodegradation at Deepwater Horizon. Science 2010, 330:201-204.
  • Cardenas E, Wu W-M, Leigh MB, Carley J, Carroll S, Gentry T, Luo J, Watson D, Gu B, Ginder-Vogel M et al.: Microbial communities in contaminated sediments, associated with bioremediation of uranium to submicromolar levels. Appl Environ Microbiol 2008, 74:3718-3729.
  • Chakraborty R, Wu CH, Hazen TC (2012) Systems biology approach to bioremediation. Curr Opin Biotechnol 23:1–8.
  • Conrad ME, Brodie EL, Radtke CW, Bill M, Delwiche ME, Lee MH, Swift DL, Colwell FS: Field evidence for co-metabolism of trichloroethene stimulated by addition of electron donor to groundwater. Environ Sci Technol 2010, 44:4697-4704.
  • Coulon F, McKew BA, Osborn AM, McGenity TJ, Timmis KN (2007) Effects of temperature and biostimulation on oil-degrading microbial communities in temperate estuarine waters. Environ Microbiol 9: 177-186.
  • Cupples AM: Real-time PCR quantification of Dehalococcoides populations: methods and applications. J Microbiol Methods 2008, 72:1-11.
  • de Lorenzo V (2008) Systems biology approaches to bioremediation. Curr Opin Biotechnol 19:579–589.
  • Deng L., Su Y., Su H., Wang X., Zhu X. Sorption and desorption of lead (II) from wastewater by green algae Cladophora fascicularis. Journal of Hazardous Materials 2007; 143 (1–2) 220–225.
  • Desai C, Pathak H, Madamwar D (2010) Advances in molecular and ‘‘-omics” technologies to gauge microbial communities and bioremediation at xenobiotic/anthropogen contaminated sites. Biores Technol 101:1558–1569.
  • Edwards BR, Reddy CM, Camilli R, Carmichael CA, Longnecker K, Van Mooy BAS: Rapid microbial respiration of oil from the Deepwater Horizon spill in offshore surface waters of the Gulf of Mexico. Environ Res Lett 2011, 6:035301.
  • Erwin DP, Erickson IK, Delwiche ME, Colwell FS, Strap JL, Crawford RL: Diversity of oxyenase genes from methane- and ammonia-oxidizing bacteria in the Eastern Snake River Plain aquifer. Appl Environ Microbiol 2005, 71:2016-2025.
  • Eyers L, Smoot JC, Smoot LM, Bugli C, Urakawa H, et al. (2006) Discrimination of shifts in a soil microbial community associated with TNT-contamination using a functional ANOVA of 16S rRNA hybridized to oligonucleotide microarrays. Environ Sci Technol 40: 5867-5873.
  • F. M. von Fahnestock, G. B. Wickramanayake, K. J. Kratzke, W. R. Major. Biopile Design, Operation, and Maintenance Handbook for Treating Hydrocarbon Contaminated Soil, Battelle Press, Columbus, OH (1998).
  • Faybishenko B, Hazen TC, Long PE, Brodie EL, Conrad ME, Hubbard SS, Christensen JN, Joyner D, Borglin SE, Chakraborty R et al.: In situ long-term reductive bioimmobilization of Cr(VI) in groundwater using hydrogen release compound. Environ Sci Technol 2008, 42:8478-8485.
  • Fields MW, Bagwell CE, Carroll SL, Yan T, Liu X, Watson DB, Jardine PM, Criddle CS, Hazen TC, Zhou J: Phylogenetic and functional biomakers as indicators of bacterial community responses to mixed-waste contamination. Environ Sci Technol 2006, 40:2601-2607.
  • Fredrickson JK, Romine MF, Beliaev AS, Auchtung JM, Driscoll ME, Gardner TS, Nealson KH, Osterman AL, Pinchuk G, Reed JL et al.: Towards environmental systems biology of Shewanella. Nat Rev Microbiol 2008, 6:592-603.
  • Fulekar MH, Geetha M, Sharma J (2009) Bioremediation of Trichlorpyr Butoxyethyl Ester (TBEE) in bioreactor using adapted Pseudomonas aeruginosa in scale up process technique. Biol Med 1(3):1–6
  • Fulekar MH, Sharma J., (2008) Bioinformatics applied in bioremediation. Innovative Romanian Food Biotechnology. 2(2) 28-36.
  • Gao J, Ellis LBM, Wackett LP (2011) The University of Minnesota pathway prediction system: multi-level prediction and visualization. Nucleic Acids Res 39:W406–W411
  • Gilbert JA, Field D, Huang Y, Edwards R, Li W, Gilna P, Joint I: Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One 2008, 3(8):e3042.
  • Han RY, Geller JT, Yang L, Brodie EL, Chakraborty R, Larsen JT, Beller HR: Physiological and transcriptional studies of Cr(VI) reduction under aerobic and denitrifying conditions by an aquifer-derived pseudomonad. Environ Sci Technol 2010, 44:7491-7497.
  • Harayama S, Kasai Y, Hara A: Microbial communities in oilcontaminated seawater. Curr Opin Biotechnol 2004, 15:205-214.
  • Hazen TC, Dubinsky EA, DeSantis TZ, Andersen GL, Piceno YM, Singh N, Jansson JK, Probst A, Borglin SE, Fortney JL, Stringfellow WT, Bill M, Conrad ME, Tom LM, Chavarria KL, Alusi TR, Lamendella R, Joyner DC, Spier C, Baelum J, Auer M, Zemla ML, Chakraborty R, Sonnenthal EL, D’haeseleer P, Holman HYN, Osman S, Lu ZM, Van Nostrand JD, Deng Y, Zhou JZ, Mason OU (2010) Deep-sea oil plume enriches indigenous oil-degrading bacteria. Science 330:204–208. doi:10.1126/ Science.1195979
  • Hazen TC, Rocha AM, Techtmann SM (2013) Advances in monitoring environmental microbes. Curr Opin Biotech 24:526–533. doi:10.1016/J.Copbio.2012.10.020 11.
  • Hazen TC, Sayler GS (2016) Environmental systems microbiologyof contaminated environments. In: Yates M, Nakatsu C,Miller RSP (eds) Manual of environmental microbiology, vol 4th edn. ASM Press, Washington, DC, pp 5.1.6-1–5.1.6-10
  • He Z, Gentry TJ, Schadt CW, Wu L, Liebich J, Chong SC, Huang Z, Wu W, Gu B, Jardine P et al.: GeoChip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical, ecological and environmental processes. ISME J 2007, 1:67-77
  • Hemme CL, Deng Y, Gentry TJ, Fields MW, Wu L, Barua S, Barry K, Tringe SG, Watson DB, He Z et al.: Metagenomic insights into evolution of a heavy metal-contaminated groundwater microbial community. ISME J 2010, 4:660-672
  • Hettich RL, Pan CL, Chourey K, Giannone RJ (2013) Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Anal Chem 85:4203–4214. doi:10.1021/ac303053e
  • Hubbard SS, Williams K, Conrad ME, Faybishenko B, Peterson J,Chen JS, Long P, Hazen T: Geophysical monitoring of hydrological and biogeochemical transformations associated with Cr(VI) bioremediation. Environ Sci Technol 2008, 42:3757-3765.
  • Illman WA, Alvarez PJ: Performance assessment of bioremediation and natural attenuation. Crit Rev Environ Sci Technol 2009, 39:209-270.
  • Jiang C. Y., Sheng X. F., Qian M., Wang Q. Y Isolation and characterization of heavy metal resistant Burkholderia species from heavy metal contaminated paddy field soil and its potential in promoting plant growth and heavy metal accumulation in metal polluted soil. Chemosphere 2008; 72:157–164.
  • Kanmani P., Aravind J., Preston D. Remediation of chromium contaminants using bacteria. International Journal of Environmental Science ad Technology 2012; 9:183–193.
  • Katsivela E, Moore ER, Maroukli D, Strömpl C, Pieper D, et al. (2005) Bacterial community dynamics during in-situ bioremediation of petroleum waste sludge in landfarming sites. Biodegradation 16: 169-180.
  • Ken Killham; Jim I. Prosser. The prokaryotes. In: Paul, E. A. (ed.). Soil Microbiology, Ecology, and Biochemistry. Oxford: Elsevier: 2007. p119–144.
  • Kessler JD, Valentine DL, Redmond MC, Du MR, Chan EW, Mendes SD, Quiroz EW, Villanueva CJ, Shusta SS, Werra LM et al.: A persistent oxygen anomaly reveals the fate of spilled methane in the deep Gulf of Mexico. Science 2011, 331:312-315.
  • Khan F, Sajid M, Cameotra SS (2013) In Silico Approach for the Bioremediation of Toxic Pollutants. J Phylogenetics Evol Biol 4:161. doi:10.4172/2157-7463.1000161
  • Kitoni, H. (2002) Systems Biology: A Brief Overview Science .01 Mar 2002: Vol. 295, Issue 5560, pp. 1662-1664.
  • Klipp E, Liebermeister W, Wierling C, Kowald A, Herwig R(2016) Systems biology: a textbook. Wiley, New York.
  • Koehmel, J. Sebastian, A., Prasad, M. N. V. (2016) Advancing Bioremediation through systems biology and synthetic biology. Chapter 26. 677-680. In Bioremediation and Bioeconomy. Ed by M. N. V. Prasad. Elsevier, USA.
  • Kujan P., Prell A., Safár H., Sobotka M., Rezanka T., Holler P. Use of the industrial yeast Candida utilis for cadmium sorption. Folia Microbiologica. 2006; 51 (4) 257–260.
  • Kumar A., Bisht B. S., Joshi V. D., Dhewa T. Review on bioremediation of polluted environment: a management tool. International Journal of Environmental Sciences 2011; 1 (6) 1079–1093.
  • Kundu, D., Hazra, C., Chaudhari, A. Bioremediation of Nitroaromatics (NACs)- Based Explosives: Integrating ‘-omics’ and unmined Microblome Richness (2014) Biological Remediation of Explosive Residues ed by. Singh, S. H. Springer. 179-199.
  • Leahy JG, Colwell RR (1990) Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. Microbiol Rev 54: 305-315.
  • Lee Y. C., Chang S. P. The biosorption of heavy metals from aqueous solution by Spirogyra and Cladophora filamentous macroalgae. Bioresource Technology 2011; 102 (9) 5297–5304.
  • Lehman RM, O’Connell SP, Banta A, Fredrickson JK, Reysenbach AL, Kieft TL, Colwell FS: Microbiological comparison of core and groundwater samples collected from a fractured basalt aquifer with that of dialysis chambers incubated in situ. Geomicrobiol J 2004, 21:169-182.
  • Liu P, Meagher RJ, Light YK, Yilmaz S, Chakraborty R, Arkin AP, Hazen TC, Singh AK: Microfluidic fluorescence in situ hybridization and flow cytometry (mFlowFISH). Lab on a Chip 2011, 11:2673-2679.
  • Lovley DR (2003) Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nat Rev Microbiol 1:35–44.doi:10.1038/nrmicro731
  • Lu Z, Deng Y, Van Nostrand JD, He Z, Voordeckers J, Zhou A, Lee Y.-J., Mason OU, Dubinsky EA, Chavarria KL et al.: Microbial gene functions enriched in the Deepwater Horizon deep-sea oil plume. ISME J, doi:10.1038/ismej.2011.91.
  • Luciene M. Coelho, Helen C. Rezende, Luciana M. Coelho, Priscila A.R. de Sousa, Danielle F.O. Melo and Nívia M.M. Coelho (2015). Bioremediation of Polluted Waters Using Microorganisms, Advances in Bioremediation of Wastewater and Polluted Soil, Prof. Naofumi Shiomi (Ed.), InTech, DOI: 10.5772/60770. Available from: intechopen.com/books/advances-in-bioremediation-of-wastewater-and-polluted-soil
  • Machado M. D., Soares E. V., Soares H. M. Removal of heavy metals using a brewer’s yeast strain of Saccharomyces cerevisiae: chemical speciation as a tool in the prediction and improving of treatment efficiency of real electroplating effluents. Journal of Hazardous Materials 2010; 180(1–3) 347–353.
  • Mane P. C., Bhosle A. B. Bioremoval of some metals by living Algae spirogyra sp. and Spirullina sp. from aqueous solution. International Journal of Environmental Research 2012; 6(2) 571–576.
  • Mejáre M., Bülow L. Metal-binding proteins and peptides in bioremediation and phytoremediation of heavy metals. Trends in Biotechnology 2001; 19 (2) 67–73.
  • Mills DK, Fitzgerald K, Litchfield CD, Gillevet PM (2003) A comparison of DNA profiling techniques for monitoring nutrient impact on microbial community composition during bioremediation of petroleum-contaminated soils. J Microbiol Methods 54: 57-74.
  • Moreels D, Bastiaens L, Ollevier F, Merckx R, Diels L, et al. (2004) Effect of in situ parameters on the enrichment process of MTBE degrading organisms. Commun Agric Appl Biol Sci 69: 3-6.
  • Moriya Y, Shigemizu D, Hattori M, Tokimatsu T, Kotera M, Goto S, Kanehisa M (2010) PathPred: an enzyme-catalyzed metabolic pathway prediction server. Nucleic Acids Res 38:W138–W143
  • Nicol GW, Schleper C: Ammonia-oxidising Crenarchaeota: important players in the nitrogen cycle? Trends Microbiol 2006, 14(5):207-212.
  • Nicolaou S. A., Gaida S. M., Papoutsakis E. T. A comparative view of metabolite and substrate stress and tolerance in microbial bioprocessing: from biofuels and chemicals, to biocatalysis and bioremediation. Metabolic Engineering 2010; 12 (4) 307–331.
  • Palumbo AV, Schryver JC, Fields MW, Bagwell CE, Zhou JZ, Yan T, Liu X, Brandt CC: Coupling of functional gene diversity and geochemical data from environmental samples. Appl Environ Microbiol 2004, 70:6525-6534
  • Pandey J, Chauhan A, Jain RK (2009) Integrative approaches for assessing the ecological sustainability of in situ bioremediation. FEMS Microbiol Rev 33: 324-375.
  • Rahm BG, Chauhan S, Holmes VF, Macbeth TW, Sorenson KSJ, Alvarez-Cohen L: Molecular characterization of microbial populations at two sites with differing reductive dechlorination abilities. Biodegradation 2006, 17:523-534.
  • Ramasamy R. K., Congeevaram S., Thamaraiselvi K. Evaluation of isolated fungal strain from e-waste recycling facility for effective sorption of toxic heavy metal Pb (II) ions and fungal protein molecular characterization-a Mycoremediation approach. Asian Journal of Experimental Biological Sciences 2011; 2(2) 342–347.
  • Roane T. M., Josephson K. L., Pepper I. L. Dual-bioaugmentation strategy to enhance remediation of cocontaminated soil. Applied and Environmental Microbiology 2001; 67 (7) 3208–3215.
  • S.R. Gill, M. Pop, R.T. DeBoy, P.B. Eckburg, P.J. Turnbaugh, B.S. Samuel, J.I. Gordon, D.A. Relman, C.M. Fraser-Liggett, K.E. Nelson Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome Science, 312 (2006), pp. 1355–1359.
  • Say R., Yimaz N., Denizli A. Removal of heavy metal ions using the fungus Penicillium canescens. Adsorption Science and Technology 2003; 21 (7) 643–650.
  • Scow KM, Hicks KA: Natural attenuation and enhanced bioremediation of organic contaminants in groundwater. Curr Opin Biotechnol 2005, 16:246-253.
  • Scragg, A. (2005) Bioremediation. In Environmental Biotechnology. Oxford. 173-229. USA.
  • Sharma S. Bioremediation: features, strategies and applications. Asian Journal of Pharmacy and Life Science 2012; 2 (2) 202–213.
  • Singh R., Singh P., Sharma R. Microorganism as a tool of bioremediation technology for cleaning environment: a review. Proceedings of the International Academy of Ecology and Environmental Sciences, 2014; 4(1) 1–6.
  • Song DL, Conrad ME, Sorenson KS, Alvarez-Cohen L: Stable carbon isotope fractionation during enhanced in situ bioremediation of trichloroethene. Environ Sci Technol 2002, 36:2262-2268.
  • Tastan B. E., Ertugrul S., Donmez G. Effective bioremoval of reactive dye and heavy metals by Aspergillus versicolor. Bioresource Technology 2010; 101(3) 870–876.
  • Techtmann, S. M., Hazen, T. C. (2016) Metagenomic applications in environmental monitoring and bioremediation J Ind Microbiol Biotechnol (2016) 43:1345–1354.
  • Thapa B., Kumar A., Ghimire A. A Review on bioremediation of petroleum hydro‐ carbon contaminants in soil. Kathmandu University Journal of Science, Engineering and Technology 2012; 8 (1) 164–170.
  • V. Desjardin, R. Bayard, N. Huck, A. Manceau, R. Gourdon Effect of microbial activity on the mobility of chromium in soils Waste Manag, 22 (2002), pp. 195–200.
  • Valentine DL, Kessler JD, Redmond MC, Mendes SD, Heintz MB, Farwell C, Hu L, Kinnaman FS, Yvon-Lewis S, Du MR et al.: Propane respiration jump-starts microbial response to a deep oil spill. Science 2010, 330:208-211.
  • Van Nostrand JD, Wu W-M, Wu L, Deng Y, Carley J, Carroll S, He Z, Gu B, Luo J, Criddle CS et al.: GeoChip-based analysis of functional microbial communities during the reoxidation of a bioreduced uranium-contaminated aquifer. Environ Microbiol 2009, 11:2611-2626.
  • Vidali M (2001) Bioremediation. An overview. Pure Appl Chem 73: 1163–1172.
  • Vullo D. L., Ceretti H. M., Daniel M. A., Ramírez S. A., Zalts A. Cadmium, zinc and copper biosorption mediated by Pseudomonas veronii 2E. Bioresource Technology 2008; 99 (13) 5574–5581.
  • Waldron PJ, Wu L, Nostrand JDV, Schadt CW, He Z, Watson DB, Jardine PM, Palumbo AV, Hazen TC, Zhou J: Functional gene array-based analysis of microbial community structure in groundwaters with a gradient of contaminant levels. Environ Sci Technol 2009, 43:3529-3534.
  • Wasilkowski D., Swedziol Ż., Mrozik A. The applicability of genetically modified microorganisms in bioremediation of contaminated environments. Chemik 2012; 66 (8) 822–826.
  • Wenderoth DF, Rosenbrock P, Abraham WR, Pieper DH, Höfle MG (2003) Bacterial community dynamics during biostimulation and bioaugmentation experiments aiming at chlorobenzene degradation in groundwater. Microb Ecol 46: 161-176.
  • Werner JJ, Ptak AC, Rahm BG, Zhang S, Richardson RE: Absolute quantification of Dehalococcoides proteins: enzyme bioindicators of chlorinated ethene dehalorespiration. Environ Microbiol 2009, 11:2687-2697.
  • Wilmes P, Bond PL: Metaproteomics: studying functional gene expression in microbial ecosystems. Trends Microbiol 2006, 14(2):92-97.
  • Y. Hu, C. Fu, Y. Yin, G. Cheng, F. Lei, X. Yang, J. Li, E. Ashforth, L. Zhang, B. Zhu Construction and preliminary analysis of a deep-sea sediment metagenomic fosmid library from Qiongdongnan Basin, South China Sea Mar Biotechnol, 12 (2010), pp. 719–727.
  • Zhou AF, He ZL, Qin YJ, Lu ZM, Deng Y, Tu QC, Hemme CL, Van Nostrand JD, Wu LY, Hazen TC, Arkin AP, Zhou JZ (2013) StressChip as a high-throughput tool for assessing microbial community responses to environmental stresses. Environ Sci Technol 47:9841–9849. doi:10.1021/es4018656
  • Zhou JZ, He Q, Hemme CL, Mukhopadhyay A, Hillesland K, Zhou AF, He ZL, Van Nostrand JD, Hazen TC, Stahl DA et al.: How sulphate-reducing microorganisms cope with stress: lessons from systems biology. Nat Rev Microbiol 2011, 9:452-466.

Funding

Disclaimer

The European Commission support for the production of this publication does not constitute endorsement of the contents which reflects the views only of the authors, and the Commission cannot be held responsi-ble for any use which may be made of the information contained therein.